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植物RNAi技術(shù)及服務(wù)
RNAi技術(shù)是研究基因功能的重要工具。其原理是對(duì)某個(gè)已知基因，設(shè)計(jì)誘導(dǎo)其沉默的dsRNA，通過合適手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體使產(chǎn)生干涉效應(yīng)的信號(hào)分子siRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)水平下降或完全沉默。通過基因表型變化，鑒定該基因功能。
1998年，F(xiàn)ire等[1]發(fā)現(xiàn)，過去利用正反義RNA阻斷基因表達(dá)都是因體外制備的單鏈RNA中污染極少量雙鏈RNA（dsRNA）所引起的，并發(fā)現(xiàn)在線蟲中導(dǎo)入dsRNA，mRNA明顯減少，推論存在某種機(jī)制特異地破壞降解內(nèi)源mRNA，導(dǎo)致某個(gè)基因沉默，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。在此情況下，啟動(dòng)子是活躍的但不能正常積累mRNA。這種現(xiàn)象被稱為RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi現(xiàn)象廣泛存在大多數(shù)真核生物中，起到自行監(jiān)控細(xì)胞中異常的mRNA、封閉該基因表達(dá)、抵御病毒感染及阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。
最初在植物中研究RNAi的實(shí)驗(yàn)是使水稻中報(bào)告基因GUS沉默，來比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導(dǎo)RNAi效率的高低。近年來利用RNAi技術(shù)在水稻、擬南芥、蕓薹屬、油菜、煙草及棉花上，已經(jīng)進(jìn)行了一些基因功能驗(yàn)證的相關(guān)研究[3]。
研究表明，在植物體中，信號(hào)分子siRNA可通過植物的維管系統(tǒng)運(yùn)輸。將目標(biāo)基因特異性序列以正向和反方分別插入標(biāo)記基因或內(nèi)含子的5’端和3’端，再在一端連接一個(gè)啟動(dòng)子，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反式重復(fù)的外源基因?qū)肷矬w，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA（iphRNA），能產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的RNAi現(xiàn)象[5]，其誘導(dǎo)目的基因沉默效率高，適用性廣，應(yīng)用潛力大。
dsRNA或iphRNA能通過以下主要兩種方法到植物：
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。將帶有能轉(zhuǎn)錄成ihpRNA的反式重復(fù)的外源基因的T-DNA質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)整合到植物基因組上。
病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）。目標(biāo)序列整合入病毒基因序列，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化ihpRNA表達(dá)。
pSGRNAi Vector---植物RNAi載體****
信諾金達(dá)已經(jīng)驗(yàn)證的植物有：擬南芥、水稻、黃花菜、紅苕，玉米等。
根據(jù)目的基因來源，可選擇構(gòu)建35S或Ubi啟動(dòng)子的RNAi載體。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指攜帶目標(biāo)基因片段的病毒侵染植物后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默、引起表型變化，進(jìn)而根據(jù)表型變異研究目標(biāo)基因的功能。VIGS是根據(jù)植物對(duì)RNA病毒防御機(jī)制發(fā)展起來的一種技術(shù)，其內(nèi)在的分子基礎(chǔ)可能是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcript gene silence)。因此，VIGS一經(jīng)建立，即被視為研究植物基因功能的強(qiáng)有力工具，得到了深入的研究和廣泛應(yīng)用，已用于煙草、番茄等植物的抗病反應(yīng)、生長發(fā)育以及代謝調(diào)控的功能基因研究。
相應(yīng)的pTRV1和pTRV2載體配套使用，用于植物RNAi。
植物RNAi載體構(gòu)建的服務(wù)要求
目的基因序列或者登錄號(hào)；
需要的啟動(dòng)子和篩選基因。
設(shè)計(jì)引物，
構(gòu)建siRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
根據(jù)要求，構(gòu)建載體；
測序驗(yàn)證。
植物RNAi載體構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容
RNAi質(zhì)粒及甘油菌株，測序報(bào)告和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
發(fā)表文獻(xiàn)精選：
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