熒光定量PCR（qPCR）介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對(duì)初始模板定量分析的問(wèn)題。熒光定量PCR具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
熒光定量PCR（qPCR）原理
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)產(chǎn)物量的變化，最終得到得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。
如圖所示 ：
圖1：qPCR擴(kuò)增曲線
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分為三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段（基線期）、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化；在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)；只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。
熒光定量PCR常用術(shù)語(yǔ)
在了解熒光定量PCR如何對(duì)初始模板進(jìn)行定量之前，需要了解幾個(gè)在熒光定量PCR分析中常用的術(shù)語(yǔ)：
- 基線：實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的最初幾個(gè)循環(huán)中（一般為3-15個(gè)循環(huán)）的信號(hào)水平。此階段的熒光信號(hào)變化量極小。低水平的基線信號(hào)相當(dāng)于反應(yīng)的背景或噪聲。每個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的基線應(yīng)通過(guò)用戶分析或擴(kuò)增曲線自動(dòng)分析，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。基線的設(shè)置，會(huì)影響到熒光閾值及Ct值。
- 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光閾值默認(rèn)是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
- Ct值：Ct值指的是PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)。
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。對(duì)已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做系列稀釋，對(duì)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據(jù)Ct值及拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)代Ct值。
如何實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量
利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣品的初始模板量進(jìn)行定量分析，需要利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值，最后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
圖2：對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
設(shè)計(jì)特定引物，利用PCR對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測(cè)序驗(yàn)證是否為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，最后收集陽(yáng)性克隆質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:測(cè)定質(zhì)粒的濃度，依據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據(jù)起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)及Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。當(dāng)需要對(duì)起始模板進(jìn)行定量時(shí)，只需要得到擴(kuò)增曲線，讀得Ct值，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程即可對(duì)起始模板定量。
熒光標(biāo)記方法
實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光標(biāo)記方法可分為熒光染料法和熒光探針?lè)▋深悺Ｈ玖戏ㄊ抢脽晒馊玖峡梢郧逗系紻NA雙鏈內(nèi)部的特性，來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。而探針?lè)ㄊ抢门c靶序列特異結(jié)合的熒光探針的信號(hào)積累來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。
熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性，來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。現(xiàn)以最常用的SYBR GreenⅠ為例，介紹染料法熒光定量PCR的工作原理：
圖3：熒光染料法原理
SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，可嵌合到雙鏈DNA的內(nèi)部。在游離狀態(tài)下，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈正比，隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加，可通過(guò)熒光信號(hào)的積累來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。
熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結(jié)合，一個(gè)模板結(jié)合一個(gè)探針。探針5'端具有報(bào)告基團(tuán)（R），可發(fā)光；3'端有熒光淬滅基團(tuán)（Q），能吸收光。探針完整時(shí)R基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，探針會(huì)被聚合酶水解，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的光沒(méi)有被淬滅基團(tuán)吸收，從而被儀器檢測(cè)到。每擴(kuò)增一條DNA鏈，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
圖4：探針原理
探針?lè)ㄅc染料法對(duì)比
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探針?lè)?/div> |
染料法 |
優(yōu)點(diǎn) |
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1.對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，適用于任何DNA
2.使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針
3.成本低
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缺點(diǎn) |
1.只適合一個(gè)特定的目標(biāo)
2.探針價(jià)格較高
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1.容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性
2.對(duì)引物特異性要求高
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