熒光定量PCR結(jié)果分析
一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法計算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在實時熒光定量PCR 技術(shù)中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。
(1)擴增曲線
圖1：qPCR擴增曲線
注：
橫坐標：代表擴增循環(huán)數(shù);
縱坐標：代表熒光強度，每個循環(huán)進行一次熒光信號收集。
(2)熒光閾值(Threshold)
在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。
(3)CT值
每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時，對于熒光PCR實驗來說，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。
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